[ Pobierz całość w formacie PDF ]
.in.: pomiar dokonywany jest w fazie logaryt-micznej PCR, sekwencja standardowa i badana są powielane z tą samą wydajnością orazwystępują w badanej próbie w podobnej ilości.Podstawowym założeniem jest to, że genymetabolizmu podstawowego ulegają stałej ekspresji we wszystkich komórkach danegoorganizmu i mogą stanowić odniesienie do badanych genów.Niestety, amplifikowanyprodukt badanego genu różni się prawie zawsze od sekwencji standardu pod względemrozmiaru, kompozycji nukleotydów oraz liczby kopii DNA.Nie ma ponadto gwarancji, żegeny metabolizmu podstawowego, używane jako wzorce, występują na niezmiennie sta- Ilościowa ocena aktywności transkrypcyjnej genów i ich kopijności oparta na technice.89łym poziomie we wszystkich badanych próbkach.Udowodniono, że poziom ekspresjitych genów może się różnić w poszczególnych tkankach oraz między liniami komórko-wymi.Standardy zewnętrzne, stanowią odmienne rozwiązanie.Są to cząsteczki DNA lubRNA dodawane w znanej ilości do reakcji QPCR.Ponieważ zarówno standardy, jak i se-kwencja docelowa są obecne w tej samej mieszaninie reakcyjnej i powielane przez te samestartery, eliminowane są błędy dotyczące wzorców wewnętrznych.Ocena ilościowa jestdokonywana na podstawie pomiaru liczby produktów wyniku amplifikacji sekwencjistandardowej i badanego genu.Technika QPCR opiera się na pomiarze fluorescencji, który odbywa się po każdymkolejnym cyklu reakcji QPCR.Oczywiście, taki pomiar ma sens tylko wówczas, gdy emisjabarwnika fluorescencyjnego (fluorochromu) jest powiązana z powstającym produktemamplifikacji.Wykorzystuje się kilka rozwiązań pozwalających na dołączenie barwnika dopowielanego fragmentu DNA.Najstarszym z nich, lecz nadal z powodzeniem i po-wszechnie stosowanym rozwiązaniem, są fluorochromy interkalujące dwuniciowe DNA.Przykładem jest stosowany do elektroforezy DNA bromek etydyny oraz barwnik SYBRGreen I (Molecular Probes).Ich działanie polega na emisji fluorescencji po wniknięciuw dwuniciową cząsteczkę DNA (niezwiązany barwnik nie wykazuje emisji).Teoretycznie,wzrost fluorescencji wynika z powielanej w każdym cyklu liczby cząstek badanego genu.W QPCR powszechnie stosowany jest SYBR-Green I, ze względu na dogodną długość falwzbudzenia i emisji (max wzb.497 nm/max em.520 nm) oraz wysoką czułość (80 pg dsDNA).Podstawową zaletą barwników interkalujących jest ich uniwersalność mogą byćstosowane w badaniach dowolnej sekwencji DNA.Niestety, obecność niespecyficznychproduktów reakcji QPCR, lub/i dimerów starterów znacznie zawyża wynik analiz.Bada-nie jest więc wiarygodne tylko wówczas, gdy są optymalnie dobrane warunki PCR; szcze-gólnie gdy powstaje wyłącznie właściwy produkt amplifikacji.Intensywność fluorescencjiSYBR Green I zależy od długości dwuniciowego fragmentu DNA ta sama liczba czą-steczek dłuższych amplimerów daje silniejszy sygnał niż krótszych, co oznacza, że doQPCR należy dobierać amplimery o podobnej długości.Z powyższych względów analizaz użyciem SYBR-Green I powinna podlegać dodatkowej kontroli.Jednym ze sposobówjest przeprowadzenie elektroforezy żelowej produktów QPCR i potwierdzenie obecnościwyłącznie specyficznego produktu.Inną możliwością jest ustalenie przez termocykler tzw.krzywej topnienia dla danego produktu amplifikacji.Zasada jest następująca: dwuniciowy produkt PCR o określonej długości i składziezasad azotowych ulega dysocjacji na pojedyncze nici w ściśle określonej temperaturze (jestto tzw.temperatura topnienia, melting temperature).Jak wspomniano, SYBR-Green wykazu-je fluorescencję wyłącznie po wniknięciu wewnątrz dwuniciowych cząsteczek DNA, takwięc dysocjacja DNA na pojedyncze nici skutkuje nagłym spadkiem fluorescencji przyosiągnięciu temperatury topnienia.Wykreślenie tej zależności (ściślej pochodnej spadkufluorescencji, patrz ryc [ Pobierz całość w formacie PDF ]
zanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl matkasanepid.xlx.pl
.in.: pomiar dokonywany jest w fazie logaryt-micznej PCR, sekwencja standardowa i badana są powielane z tą samą wydajnością orazwystępują w badanej próbie w podobnej ilości.Podstawowym założeniem jest to, że genymetabolizmu podstawowego ulegają stałej ekspresji we wszystkich komórkach danegoorganizmu i mogą stanowić odniesienie do badanych genów.Niestety, amplifikowanyprodukt badanego genu różni się prawie zawsze od sekwencji standardu pod względemrozmiaru, kompozycji nukleotydów oraz liczby kopii DNA.Nie ma ponadto gwarancji, żegeny metabolizmu podstawowego, używane jako wzorce, występują na niezmiennie sta- Ilościowa ocena aktywności transkrypcyjnej genów i ich kopijności oparta na technice.89łym poziomie we wszystkich badanych próbkach.Udowodniono, że poziom ekspresjitych genów może się różnić w poszczególnych tkankach oraz między liniami komórko-wymi.Standardy zewnętrzne, stanowią odmienne rozwiązanie.Są to cząsteczki DNA lubRNA dodawane w znanej ilości do reakcji QPCR.Ponieważ zarówno standardy, jak i se-kwencja docelowa są obecne w tej samej mieszaninie reakcyjnej i powielane przez te samestartery, eliminowane są błędy dotyczące wzorców wewnętrznych.Ocena ilościowa jestdokonywana na podstawie pomiaru liczby produktów wyniku amplifikacji sekwencjistandardowej i badanego genu.Technika QPCR opiera się na pomiarze fluorescencji, który odbywa się po każdymkolejnym cyklu reakcji QPCR.Oczywiście, taki pomiar ma sens tylko wówczas, gdy emisjabarwnika fluorescencyjnego (fluorochromu) jest powiązana z powstającym produktemamplifikacji.Wykorzystuje się kilka rozwiązań pozwalających na dołączenie barwnika dopowielanego fragmentu DNA.Najstarszym z nich, lecz nadal z powodzeniem i po-wszechnie stosowanym rozwiązaniem, są fluorochromy interkalujące dwuniciowe DNA.Przykładem jest stosowany do elektroforezy DNA bromek etydyny oraz barwnik SYBRGreen I (Molecular Probes).Ich działanie polega na emisji fluorescencji po wniknięciuw dwuniciową cząsteczkę DNA (niezwiązany barwnik nie wykazuje emisji).Teoretycznie,wzrost fluorescencji wynika z powielanej w każdym cyklu liczby cząstek badanego genu.W QPCR powszechnie stosowany jest SYBR-Green I, ze względu na dogodną długość falwzbudzenia i emisji (max wzb.497 nm/max em.520 nm) oraz wysoką czułość (80 pg dsDNA).Podstawową zaletą barwników interkalujących jest ich uniwersalność mogą byćstosowane w badaniach dowolnej sekwencji DNA.Niestety, obecność niespecyficznychproduktów reakcji QPCR, lub/i dimerów starterów znacznie zawyża wynik analiz.Bada-nie jest więc wiarygodne tylko wówczas, gdy są optymalnie dobrane warunki PCR; szcze-gólnie gdy powstaje wyłącznie właściwy produkt amplifikacji.Intensywność fluorescencjiSYBR Green I zależy od długości dwuniciowego fragmentu DNA ta sama liczba czą-steczek dłuższych amplimerów daje silniejszy sygnał niż krótszych, co oznacza, że doQPCR należy dobierać amplimery o podobnej długości.Z powyższych względów analizaz użyciem SYBR-Green I powinna podlegać dodatkowej kontroli.Jednym ze sposobówjest przeprowadzenie elektroforezy żelowej produktów QPCR i potwierdzenie obecnościwyłącznie specyficznego produktu.Inną możliwością jest ustalenie przez termocykler tzw.krzywej topnienia dla danego produktu amplifikacji.Zasada jest następująca: dwuniciowy produkt PCR o określonej długości i składziezasad azotowych ulega dysocjacji na pojedyncze nici w ściśle określonej temperaturze (jestto tzw.temperatura topnienia, melting temperature).Jak wspomniano, SYBR-Green wykazu-je fluorescencję wyłącznie po wniknięciu wewnątrz dwuniciowych cząsteczek DNA, takwięc dysocjacja DNA na pojedyncze nici skutkuje nagłym spadkiem fluorescencji przyosiągnięciu temperatury topnienia.Wykreślenie tej zależności (ściślej pochodnej spadkufluorescencji, patrz ryc [ Pobierz całość w formacie PDF ]